Ligationsberegner

Kategori: Biologi
- marts 21, 2025
| |

Vector DNA

Insert DNA

Ligation Reaktionsopsætning

Anbefalet Insert Mængde
8.3 ng
0.33 μL af insert lager
Vector Mængde
50 ng
Bruger 1 μL af vector lager
Insert:Vector Forhold
3:1 (molær)
Optimalt til standard kloning

Komplet Reaktionsopsætning

Komponent Volumen (μL) Endelig Mængde
Vector DNA (50 ng/μL) 1.0 50 ng
Insert DNA (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
10× T4 DNA Ligase Buffer 2.0 1×
T4 DNA Ligase 1.0 400 U
Nukleasefrit Vand 15.67 Til 20 μL
Total Volumen 20.0

Optimeringstips

Baseret på dine inputparametre, her er nogle anbefalinger:

  • For 5' klæbrige ender med et vector:insert forhold på 1:3, inkuber ved 16°C i 4 timer.
  • CIP-behandling af vectoren vil hjælpe med at reducere selv-ligation baggrund.
  • Hvis transformations-effektiviteten er lav, prøv at øge insert:vector forholdet til 5:1.
  • For stumpe ender ligationer, øg ligasekoncentrationen og forlæng ligationstiden.
  • Varme-inaktiver ligasen ved 65°C i 10 minutter før transformation for bedste resultater.

Om DNA Ligation

  • DNA ligation indebærer sammenføjning af DNA-fragmenter gennem dannelse af phosphodiesterbindinger.
  • T4 DNA ligase kræver ATP og Mg²⁺ for at fungere korrekt (leveres i ligationsbufferen).
  • Klæbrige ender ligationer er mere effektive end stumpe ender ligationer.
  • Vector:insert molærforhold varierer typisk fra 1:3 til 1:5 for standard kloning.
  • Højere insert:vector forhold (3:1 til 10:1) anbefales til stumpe ender ligationer eller større inserts.
  • Dephosphorylering af vectorer (ved brug af CIP, SAP, etc.) forhindrer selv-ligation af vectoren.
  • Quick ligase systemer kan reducere ligationstiden til 5-15 minutter ved stuetemperatur.

Formel for Indsætningsmængde (ng):

\[ \text{Indsæt ng} = \left( \frac{\text{Vektor ng} \times \text{Indsætningsstørrelse i kb}}{\text{Vektorstørrelse i kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Indsætningsmol}}{\text{Vektormol}} \right) \]

Hvad er Ligation Calculator?

Ligation Calculator er et værktøj, der hjælper forskere med at bestemme den passende mængde vektor og indsætnings-DNA, der kræves for en vellykket ligationsreaktion. DNA-ligation er et kritisk skridt i molekylær kloning, hvor et DNA-indsæt forbindes til en plasmidvektor ved hjælp af et enzym kaldet DNA-ligase.

Hvordan fungerer det?

Denne lommeregner giver brugerne mulighed for at indtaste detaljer om deres vektor og indsæt, herunder længde og koncentration. Baseret på det valgte molære forhold beregner den den nødvendige mængde indsætnings-DNA for at opnå en optimal ligationsreaktion.

Nøglefunktioner

  • Beregner vektor-til-indsæt molære forhold for forskellige kloningsscenarier.
  • Understøtter både standard og brugerdefinerede molære forhold.
  • Giver anbefalinger til ligationsbetingelser baseret på kloning med klæbrige eller blottede ender.
  • Inkluderer optimeringstips til forbedring af ligationseffektivitet.

Sådan bruger du lommeregneren

  1. Indtast vektorlængden (bp) og koncentrationen (ng/μL).
  2. Indtast indsætlængden (bp) og koncentrationen (ng/μL).
  3. Vælg det ønskede vektor-til-indsæt molære forhold (f.eks. 1:3, 1:5).
  4. Angiv det samlede reaktionsvolumen (f.eks. 20 μL).
  5. For avancerede indstillinger, vælg ligationstemperatur, varighed, ligase-type og vektorbehandlingsmuligheder.
  6. Klik på “Beregne” for at generere den anbefalede indsætningsmængde og reaktionsopsætning.

Ofte stillede spørgsmål

Hvad er det optimale vektor-til-indsæt molære forhold?

For kloning med klæbrige ender anbefales generelt et 1:3 eller 1:5 vektor-til-indsæt forhold. For kloning med blottede ender kan et højere forhold (f.eks. 1:5 til 1:10) forbedre effektiviteten.

Hvorfor anbefales dephosphorylering af vektoren?

Dephosphorylering (ved brug af CIP, SAP eller Antarctic Phosphatase) forhindrer selv-ligation af vektoren, hvilket reducerer uønskede baggrundskolonier.

Hvilke ligationsbetingelser skal jeg bruge?

  • 16°C i 4 timer – Standardbetingelse for T4 DNA-ligase.
  • Stue temperatur i 15 minutter – Egnet til Quick Ligase.
  • Over nat ved 16°C – Anbefales til udfordrende ligationer eller kloning med blottede ender.

Hvordan kan jeg forbedre ligationseffektiviteten?

  • Sikre korrekt molært forhold for vektor og indsæt.
  • Brug frisk DNA-ligase og buffer.
  • Optimere ligationsbetingelser (temperatur og varighed).
  • Bekræft indsæts tilstedeværelse via gel-elektroforese før ligation.

Hvorfor bruge denne lommeregner?

Denne Ligation Calculator forenkler opsætningen af DNA-ligationsreaktioner, hvilket hjælper forskere med at bestemme de rigtige mængder af vektor og indsæt for effektiv kloning. Ved at automatisere beregninger og tilbyde optimeringstips sparer den tid og øger succesraten for ligationseksperimenter.